Što je kvantifikacija RNA?

Kvantifikacija ribonukleinske kiseline (RNA) je način određivanja prosječne koncentracije RNA u otopini. Ovo se određivanje može izvesti korištenjem raznih postupaka, koji obično spadaju u jednu od dvije kategorije: spektrofotometrija ili kvantifikacija fluorescentne boje. Spektrofotometrija se oslanja na sposobnost RNA da apsorbira određene valne duljine ultraljubičastog svjetla. Neke fluorescentne boje, kao što je etidijev bromid, mogu se vezati na nukleinske kiseline poput RNA i fluorescirati će kada se vežu, omogućujući mjerenje svjetline.

Kada je RNA izložena ultraljubičastom svjetlu, ona će selektivno apsorbirati tu svjetlost na valnim duljinama od 260 nanometara (nm) i 280 nm. Ova metoda se izvodi u spektrofotometru, koji proizvodi valne duljine ultraljubičastog svjetla i mjeri svjetlost koja prolazi kroz RNA. Veće koncentracije RNA će apsorbirati više svjetla.

Kombinacija ove dvije valne duljine često se koristi u kvantificiranju RNA jer ova metoda omogućuje istraživačima da saznaju je li uzorak kontaminiran drugim makromolekulama, kao što su proteini. Ovi zagađivači često će selektivno apsorbirati svjetlost od 280 nm, ali ne i svjetlost na 260 nm. Kao rezultat toga, izračun omjera apsorbirane svjetlosti na obje valne duljine može odrediti stupanj onečišćenja.

Kvantifikacija RNA korištenjem fluorescentnih boja daje rezultate koji su manje osjetljivi na neke kontaminante i mogu se koristiti s niskim razinama RNA koje bi onemogućavale spektrofotometriju. Boje poput etidijevog bromida vezat će se na RNA, a rezultirajuća svjetlina može se izravno izmjeriti pomoću fluorescentnih fotometara. Ako fotometar nije dostupan, mogu se pripremiti otopine s poznatim koncentracijama RNA, a svjetlina nepoznatog uzorka može se grubo usporediti s njima. Odnos između osvjetljenja i koncentracije RNA je linearan, tako da istraživači mogu brzo odrediti mjerenje koncentracije iz svjetline.

Kvantifikacija RNA korištenjem bilo koje metode može biti vrlo osjetljiva na različite kontaminante. Proteini, fenol i velike čestice mogu učiniti rezultate spektrofotometrije netočnima. Ovi kontaminanti ne utječu na kvantificiranje RNA fluorescentne boje, ali ova metoda može biti netočna zbog prisutnosti deoksiribonukleinske kiseline (DNA) u uzorku.

Boje koje vežu nukleinske kiseline vezat će i DNK i RNA, i pokazivat će slične svjetline, pa je važno osigurati čist uzorak RNA. Uobičajeni način da se to postigne je dodavanje enzima koji uništava DNK, kao što je DNAza, u miješani uzorak prije dodavanja boje. Ovisno o koncentraciji RNA u uzorku i prisutnim kontaminantima, laboratoriji mogu koristiti bilo koju od ovih metoda za kvantificiranje RNA.