Enzim citrat sintaza katalizira prvi korak u staničnom metaboličkom procesu koji se naziva ciklus limunske kiseline. Taj se proces događa u većini životinjskih, biljnih i bakterijskih stanica, proizvodeći staničnu energiju za život, u obliku molekule zvane ATP. Prvi korak ove lančane reakcije koristi produkte metabolizma šećera za proizvodnju tvari zvane citrat, koja se zatim dalje obrađuje kako bi se dobila energija. Poput mnogih enzima, citrat sintaza se prvo mora vezati na određenu molekulu, njen supstrat, prije nego što postane kemijski aktivna.
Citrat sintaza se proizvodi u gotovo svim tipovima stanica. To je katalizator koji pokreće prvi korak osnovne metaboličke reakcije poznate kao ciklus limunske kiseline ili Krebsov ciklus, koji se javlja u svim organizmima kojima je za metabolizam potreban kisik. Ciklus limunske kiseline proizvodi ATP, molekulu koja se koristi za pokretanje osnovnih procesa živih stanica, poput disanja i reprodukcije. Citrat sintaza je prvi enzim u dugom lancu katalizatora za Krebsov ciklus, a proizvedena količina regulira brzinu kojom se cijeli ciklus može nastaviti.
Kao i svi enzimi, citrat sintaza ima specifičnu strukturu proteina koja joj omogućuje kataliziranje reakcija. Postoji u tijelu u dva odvojena stanja na temelju njegove konformacije ili oblika: aktivna i neaktivna varijanta. Tijekom glikolize, šećerna glukoza, dobivena iz hrane, metabolizira se u razne kemikalije, uključujući dvije molekule acetata koje pomažu u pokretanju Krebsovog ciklusa. Kada se veže molekulom oksaloacetata, citrat sintaza mijenja svoju konformaciju i otvara područje na svojoj površini na koje se veže acetil-CoA.
Mehanizam citrat sintaze zahtijeva aktivaciju, koja se događa kada se veže na spoj koji se zove njegov supstrat, u ovom slučaju oksaloacetat, u procesu koji se naziva inducirano spajanje. Neaktivna konformacija citrat sintaze poznata je kao njezin otvoreni oblik. Kao i drugi proteini, ovaj enzim se sastoji od mnogih molekula aminokiselina. Kada se veže na oksaloacetat, oblik se mijenja jer su određene aminokiseline povezane zajedno, zatvarajući se i tvoreći svojevrsni krug oko supstrata. Ovaj zatvoreni oblik je aktivacijski oblik koji omogućuje nastavak ciklusa limunske kiseline.
Nakon što se enzim veže na acetil-CoA, on veže dio acetilnih molekula na oksaloacetat, dok u isto vrijeme kemijski uklanja dio CoA. Preneseni dio, molekula acetata s dva ugljika, tada se veže na oksaloacetat, sintetizirajući novi spoj sa šest ugljika nazvan citrat. Ova reakcija omogućuje da se ugljikovi atomi u spojevima pomaknu dalje niz ciklus limunske kiseline u molekuli koja se lako prenosi, gdje će sudjelovati u nizu metaboličkih transformacija kojima stanica stvara više ATP-a.