Alexander Fleming, škotski bakteriolog u Londonu, otkrio je penicilin greškom kada je pokušavao proučavati bakteriju Staphylococcus 1928. Vodio je eksperimente s bakterijama u svom laboratoriju u londonskoj bolnici St. Mary’s i postavio laboratorijsku posudu s bakterijom blizu otvoren prozor. Po povratku na eksperiment, otkrio je da je neka plijesan ušla kroz otvoreni prozor na posudu, kontaminirajući bakterije.
Umjesto da baci svoj pokvareni eksperiment, Fleming ga je pomno pogledao pod svojim mikroskopom. Iznenađujuće, vidio je ne samo plijesan koja raste na bakterijama, već i jasnu zonu oko plijesni. Plijesan Penicillium, preteča penicilina, otapala je smrtonosnu bakteriju Staphylococcus.
Fleming je izvorno bio optimističan da će penicilin biti koristan kao antibakterijski agens, jer je siguran za ljudsko tijelo, ali moćan. Kasnije, 1931. godine, promijenio je mišljenje i odlučio da neće trajati kod ljudi onoliko koliko je potrebno za ubijanje štetnih bakterija, te ga je prestao proučavati. Godine 1934. započeo je još nekoliko godina kliničkih ispitivanja i pokušao pronaći nekoga drugoga da ga pročisti.
Istraživači sa Sveučilišta Oxford u Engleskoj, uključujući Howarda Floreya, Ernsta Chaina i Normana Heatleya, eksperimentirali su s Flemingovim otkrićem. Dokazali su da bi penicilin bio i bezopasan i učinkovit kod miševa, ali još nisu imali količinu potrebnu za liječenje ljudi. Orvan Hess i John Bumstead bili su prvi ljudi koji su ga upotrijebili za uspješno liječenje pacijenta.
Penicilin je spasio živote mnogih vojnika u Drugom svjetskom ratu, ali je zaliha bila izrazito ograničena, a lijek se brzo izlučivao iz organizma, pa su se pacijenti morali često dozirati. U ovom trenutku bila je uobičajena praksa čuvati urin pacijenata koji su bili podvrgnuti liječenju kako bi se penicilin mogao izolirati i ponovno upotrijebiti. Utvrđeno je da drugi agens, probenecid, produljuje trajanje penicilina u ljudskom tijelu.
Fleming, Florey i Chain dobili su Nobelovu nagradu za medicinu 1945. za otkriće i razvoj penicilina. Florey je bio otvoreno zabrinut zbog mogućnosti eksplozije stanovništva kao posljedica poboljšanja zdravstvene zaštite i rekao je da je njegov rad s antibiotikom više zanimljiv znanstveni problem nego način da se pomogne ljudima. Priznao je da je činjenica da bi to moglo pomoći ljudima bila dobra stvar, ali ne i zašto ga je izvorno zanimalo.
Andrew J. Moyer kasnije je otkrio kako napraviti velike količine penicilina, patentirao proces i unaprijedio borbu protiv zaraznih bolesti. Godine 1987. uvršten je u Nacionalnu kuću slavnih izumitelja zbog svog procesa stvaranja penicilina u velikim količinama.