Kako se određuje razina fosforilacije?

Razina fosforilacije organskih molekula ili tvari određuje se pomoću dvije metode: western blotting i masena spektrometrija. Fosforilacija se najčešće odnosi na vezanje fosfata za protein. Kada se fosfati vežu na proteine, prirodni procesi i funkcije proteinskih enzima u ljudskom tijelu su poremećeni. Određivanje razine fosforilacije ključno je za liječenje širokog spektra bolesti, od raka do dijabetesa.

Western blotting je popularna metoda koja se koristi za određivanje razine fosforilacije određenog skupa proteina. Protutijela kao što su anti-fosfo-tirozin monoklonska antitijela se obično koriste jer se lako vežu na ostatke tirozina proteina, na koje utječe fosforilacija. U Western blottingu, proteini se najprije odvajaju po veličini pomoću metode električnog naboja poznatog kao gel elektroforeza.

Proteini se zatim prenose na membranu koja je prekrivena posebnim antitijelima koja se vežu na fosfate na proteinima. Nakon što se proteini prenesu, antitijela će se zalijepiti za sve proteine ​​s vezanim fosfatom. Razina fosforilacije se tada može odrediti rendgenskim snimkom membrane. Svi zahvaćeni proteini dat će bljesak svjetla, što će istraživaču olakšati mjerenje razine fosforilacije.

Masena spektrometrija je još jedan način za mjerenje razine fosforilacije tvari. Ovaj proces pretvara proteinske molekule u ione, što ih čini lakšim za praćenje i mjerenje. Uzorak se ionizira pomoću ionskog izvora velike snage koji preplavi uzorak elektronima. Ovo djelovanje pretvara uzorak u katione, pozitivno nabijene ione.

Analizator mase masenog spektrometra razdvaja ione po njihovoj masi i intenzitetu naboja. To omogućuje istraživaču da otkrije omjer mase i naboja, što je ključno za otkrivanje razine fosforilacije uzorka. Konačno, detektor mjeri ione kako bi se podaci mogli prikazati u obliku grafikona. Grafikon prikazuje omjer mase i naboja iona na x-osi i relativni intenzitet iona na y-osi.

Razine fosforilacije također se mogu mjeriti tijekom fosforilacije supstrata. Fosforilacija supstrata je proces koji stvara adenozin trifosfat (ATP), molekulu kritičnu za prijenos energije između stanica, tijekom glikolize. Taj se proces događa i u životinjskim i biljnim stanicama.
U biljnim stanicama molekule ATP-a nastaju korištenjem sunčeve energije. Ova energija potiče fosforilaciju u kloroplastima biljke, mjestu biljne fotosinteze. Razina fosforilacije korelira s količinom fosfata koja je potrebna za stvaranje dodatnih ATP molekula.