Koje su različite metode određivanja koncentracije proteina?

Postoje stotine različitih metoda za određivanje koncentracije proteina. Nevjerojatna raznolikost vrsta proteinskih otopina koje biokemičari analiziraju razlog je zašto ne postoji jedinstvena univerzalna metoda koja radi za svaku vrstu proteinske otopine. Najčešći testovi proteina su Bradfordov test, Lowryjev test i test bicinhoninske kiseline. Ipak, razvijeno je bezbroj varijacija prema potrebi kako bi se zaobišla svaka potencijalna kemijska nekompatibilnost između otopine proteina i reagensa koji se koriste u testu.

Općenito govoreći, postoje dvije glavne kategorije testova za određivanje koncentracije proteina. U prvoj skupini metoda, u otopinu proteina dodaje se šarena ili fluorescentna boja, koja se specifično veže na protein. Vezana boja ima jedinstvenu valnu duljinu apsorpcije koja je proporcionalna količini proteina. Korištenjem spektrometra postaje moguće procijeniti koncentraciju proteina.

Druga skupina testova uključuje dodavanje iona bakra(II) u otopinu proteina, gdje se ti ioni reduciraju u ione bakra(I). Ovi reducirani ioni su tada sposobni tvoriti šarene komplekse vežući se na proteine. Mjerenjem apsorbancija na njihovim jedinstvenim valnim duljinama, također se mogu zaključiti koncentracije proteina.

Jedna od najpopularnijih metoda za određivanje koncentracije proteina je Bradfordov test. U ovom testu, crvena boja pod nazivom coomassie brilliant blue dodaje se u proteinsku otopinu u kiselim uvjetima. Kako se ova boja veže na protein, tvori trajni plavi kompleks s karakterističnom apsorpcijom od 595 nanometara.

Unatoč općoj svestranosti Bradfordovog testa, on je nekompatibilan s nekim proteinskim otopinama. Konkretno, Bradfordov test je poremećen prisutnošću natrijevog dodecil sulfata (SDS), deterdženta koji se obično koristi za pročišćavanje proteina i razgradnju stanica lizom. Ovaj deterdžent ometa vezanje boje za proteine, što rezultira nepouzdanim i netočnim očitavanjem apsorpcije. Druge vrste metoda, dakle, moraju se koristiti kada je prisutan SDS.

Razvijena je još jedna serija proteinskih testova, a svi oni uključuju varijaciju biuret testa. U ovoj reakciji protein se kombinira s vodenom bazom i ionima bakra(II). Ti se ioni reduciraju i zatim keliraju proteinom kako bi tvorili šarene komplekse. Dva testa koji koriste ovaj test su Lowryjev test i test bicinhoninske kiseline.
Uz Lowryjev test, biuret testu se dodaje Folin-Ciocalteu reagens. Folin-Ciocalteu reagens oksidira aromatične ostatke, osobito triptofan, i pomaže kompleksu da se snažno apsorbira na 750 nanometara. Test bicinhoninske kiseline, s druge strane, uključuje dodavanje bicinhoninske kiseline biuret testu. Nakon kratke inkubacije na oko 104° Fahrenheita (40° Celzijusa), dva ekvivalenta kiseline i peptidne veze proteina keliraju jedan ion bakra(I). Rezultat je kompleks koji snažno apsorbira na 562 nanometra.

Prilikom odabira metode za određivanje koncentracije proteina važno je uzeti u obzir različite kemijske funkcionalne skupine prisutne u otopini. Prisutnost određenih bočnih lanaca aminokiselina, disulfidnih veza i kofaktora može učiniti određivanje koncentracije proteina krajnje netočnim. Često je potrebno uzeti u obzir ne samo proteine ​​nego i druge reagense i pufere, kao što su redukcijska sredstva i deterdženti. Idealna metoda bit će kemijski kompatibilna, kao i pouzdana, jeftina i jednostavna za postavljanje.