Spektrofotometarska apsorbancija odnosi se na količinu svjetlosti koju apsorbira otopina, mjerenu laboratorijskim instrumentom koji se naziva spektrofotometar apsorpcije. U kemiji i biologiji spektrofotometri se koriste u razne svrhe. Oni mogu pomoći identificirati spojeve, odrediti koncentracije otopina ili procijeniti broj stanica suspendiranih u tekućini. Spektrofotometri rade usmjeravajući filtrirani skup određenih valnih duljina svjetlosti kroz otopinu uzorka i na svjetlomjer. Količina svjetlosti koju uzorak prenosi ili apsorbira, kao i apsorbirane valne duljine, otkrivaju neka svojstva uzorka.
Svjetlost koju ljudska bića opažaju vizualno je oblik energije, elektromagnetskog zračenja i uključuje raspon valnih duljina u malom dijelu elektromagnetskog spektra. Gama zrake, X-zrake i druge kratke valne duljine ispod 400 nanometara (nm) nisu vidljive ljudskom oku, a nisu ni valne duljine duže od 700 nm, kao što su infracrveno svjetlo ili radio valovi. Boje koje ljudi percipiraju kreću se od kraćih plavih i ljubičastih valova oko 400 nm kroz dugu do crvene, što je bliže 700 nm. Spektrofotometri mjere u vidljivom rasponu uz nešto preklapanja u ultraljubičastim i infracrvenim dijelovima spektra.
Kada vidimo boju, na primjer zeleni list, vidimo valne duljine svjetlosti koje ta stavka prenosi. U slučaju zelenog lista, spoj u stanicama biljke koji se zove klorofil apsorbira plave i crvene valne duljine bijele sunčeve svjetlosti, ali ne apsorbira jako zelenu. Umjesto toga, zelene i gotovo zelene valne duljine se prenose, a biljka izgleda zelena.
U bilo kojoj tekućoj otopini neke će valne duljine svjetlosti biti apsorbirane u većim količinama od drugih. Spektrofotometri usmjeravaju snop bijele svjetlosti kroz otopinu uzorka koja se proučava. Spektrofotometarska apsorbancija je količina svjetlosti koju apsorbira spoj koji se proučava. Ova svjetlost se apsorbira u različitim količinama u rasponu valnih duljina poznatih kao apsorpcijski spektar.
Spektar apsorpcije može pomoći u identifikaciji spoja uzorka. Na primjer, neki biljni pigmenti apsorbiraju različite valne duljine od klorofila i mogu se međusobno razlikovati po svojim apsorpcijskim dijagramima – grafikonima na kojima je apsorpcija spektrofotometra prikazana kao funkcija valne duljine. Valne duljine koje se apsorbiraju u najvećoj količini pojavit će se kao šiljci na grafikonu, dajući grafikonu svakog spoja karakterističan oblik.
Koncentracija otopine također se može zaključiti iz njezine apsorbancije spektrofotometra. To se postiže pomoću Lambert-Beerovog zakona, također poznatog kao Beerov zakon, koji je jednadžba koja povezuje razinu apsorpcije spektrofotometra s koncentracijom kroz dva druga čimbenika: koeficijent ekstinkcije i duljinu puta, odnosno širinu cijevi za uzorke. Koeficijent ekstinkcije je kemijski faktor koji je različit za svaki spoj, ali se može odrediti ispitivanjem uzorka poznate koncentracije u spektrofotometru. Beerov zakon se tada može koristiti za rješavanje nepoznatih koncentracija istog spoja.