Biblioteka gena je izraz za zbirke fragmenata deoksiribonukleinske kiseline (DNA) koji su nasumično klonirani iz genoma organizama. Oni su klonirani kao plazmidi koji se mogu replicirati odvojeno od svojih kromosoma i faga, koji su parazitski virus koji se hrani bakterijama. Kada se kloniraju kao plazmidi, zbirka se sastoji od stanica domaćina i svaka od stanica sadrži fragment DNA. Knjižnice gena faga sastoje se od onoga što se naziva fagnim lizatima, a to su ostaci uništenih stanica s umetnutim fragmentom DNA. Kada biblioteke gena sadrže zbirku svih genetskih informacija o organizmu, smatraju se reprezentativnom bibliotekom gena.
Osim toga, knjižnice mogu koristiti staničnu rekombinantnu nukleinsku kiselinu (RNA) za pričvršćivanje materijala, a ova zbirka stanica domaćina s rekombinantnim vektorima poznata je kao biblioteka gena cRNA. Probirom genske biblioteke pronalazi se određene stanice koje sadrže vektore za kloniranje s određenim genom koji se traži u biblioteci gena, a zatim se koristi jedna od mnogih tehnika njihovog izoliranja i prikupljanja. Nakon što se sakupe, stanice se smatraju kloniranim. Kako bi se imala razumna šansa za izolaciju i kloniranje određenog gena, obično se koriste samo knjižnice reprezentativnih gena jer se svaki gen i svaki izvorni DNA fragment određenog genoma prikupljaju u njemu. Kako bi se postigla 99% šanse za lociranje određenog ljudskog gena za kloniranje, više od 600,000 kloniranih stanica moralo bi se pregledati kako bi se pronašao željeni gen iz reprezentativne biblioteke gena.
DNK se ekstrahira iz organizma kako bi se pokrenula biblioteka gena. Knjižnica je strukturirana tako da organizira DNK i njezine tisuće različitih gena. Knjižnica postaje zbirka desetaka tisuća kolonija bakterija, od kojih je svaka modulirana fragmentom DNK iz organizma koji sadrži gen od posebnog interesa. Knjižnice također sadrže restrikcijske enzime i plazmid. Restrikcijski enzimi se koriste za čitanje informacija o nukleotidima DNA i koriste se za rezanje DNK na fragmente odvajanjem nukleotida jedan od drugog.
Isti restrikcijski enzimi režu bakterijske plazmide, a fragmenti i plazmidi se kombiniraju u epruveti kako bi se spojili, stvarajući novu kombinaciju. Ovi rekombinantni plazmidi se zatim vraćaju natrag u kulturu bakterija pomoću toplinskog šoka ili elektroporacije. Ovi se koraci izvode iznova i iznova dok se cijela biblioteka gena ne formira za određeni genomski organizam iz svih fragmenata originalne ekstrakcije DNA.