Proteini su građeni od lanaca aminokiselina, od kojih svaka ima različite pH vrijednosti. Ukupni pH proteina sastoji se od mješavine pH vrijednosti pojedinačnih aminokiselina dok tvore ione u određenoj otopini u kojoj su otopljene. Izoelektrična točka (pI) proteina je pH pri kojem taj protein nema neto naboj. Ovo svojstvo može se iskoristiti za odvajanje proteina s poznatim pI od drugih proteina u heterogenoj smjesi.
Aminokiseline imaju amino terminalnu skupinu koja je bazična, s visokim pH. Drugi kraj aminokiseline je karboksilni terminal koji je kisel, s niskim pH. Pri različitim pH vrijednostima, aminokiseline na proteinima će varirati u svom naboju. Proteini ispod svoje izoelektrične točke imaju pozitivan naboj. Nasuprot tome, oni iznad ove točke imaju negativan naboj.
Kako bi se iskoristilo znanje o izoelektričnoj točki za pročišćavanje proteina, mješavina proteina je podvrgnuta električnom polju. To se obično radi u agaroznim ili poliakrilamidnim gelovima, a poznato je kao izoelektrično fokusiranje. Starija tehnika je izvođenje postupka u većoj skali u staklenom stupcu pomoću otopine saharoze s elektrodama na svakom kraju. Dodaju se spojevi zvani amfoliti koji uzrokuju stvaranje dosljednog pH gradijenta. Kada se gel ili stupac podvrgnu električnoj struji, proteini migriraju dok ne dostignu svoju izoelektričnu točku, a zatim ostaju nepomični.
Proteini na gelovima općenito su vidljivi pomoću boje koja veže proteine. Ponekad, ako se proučavaju enzimi, može se koristiti supstrat koji daje obojenu reakciju. Obično se koriste standardi koji imaju proteine poznatih izoelektričnih točaka.
Kada se zna gdje se željeni protein nalazi, uobičajena tehnika je izrezati izolirani protein iz gela. Protein se tada može pročistiti i sekvencirati. Nakon što je slijed poznat, može se koristiti za dizajniranje primera za lančanu reakciju polimeraze (pcr) i koristiti za kloniranje gena za protein ako je dostupan odgovarajući materijal nukleinske kiseline.
Izoelektrično fokusiranje također je uobičajen način analize blisko povezanih proteina kako bi se vidjelo koliko su međusobno različiti. Jedna od komplikacija može biti to što proteini mogu imati povezane šećere. To se zove glikozilacija i može utjecati na pI proteina. Može izgledati kao da postoji više proteina s različitim izoelektričnim točkama, dok zapravo postoji samo jedan protein koji je različito glikoziliran. Proteini pročišćeni standardnim metodama kao što je kromatografija ponekad se analiziraju izoelektričnim fokusiranjem kako bi se osigurala njihova čistoća.