Izoelektrično fokusiranje (IEF), također zvano elektrofokusiranje, način je odvajanja molekula na temelju razlika u njihovom električnom naboju. To je vrsta elektroforeze, fenomen gdje se čestice mogu raspršiti u tekućini primjenom konstantnog električnog polja. U živim stanicama izoelektrično fokusiranje događa se prirodno, ali se često ponovno stvara u laboratoriju pomoću proteina suspendiranih u gelu.
Sposobnost odvajanja molekula u izoelektričnom fokusiranju temelji se na razumijevanju pH razine različitih proteina. Proteini mogu imati pH između 1 i 12. Neto naboj proteina bit će određen pH razinom lokalnog okoliša. Na primjer, protein može imati neutralan, pozitivan ili negativan neto naboj na temelju pH okoline.
Neto naboj bilo kojeg proteina je ukupan zbroj njegovih pozitivnih i negativnih naboja. To je određeno jesu li amino lanci koji čine protein kiseli ili bazični. Kada ima više kiselih skupina nego bazičnih skupina, rezultirajući pH bit će nizak ili kisel. Kada ima više bazičnih skupina nego kiselih skupina, rezultirajući pH bit će visok ili bazičan. Većina proteina će imati pH od 3-12, s velikom koncentracijom u rasponu od 4-7.
Proteini su pozitivno nabijeni kada se nalaze u otopini koja ima pH vrijednost nižu od one samog proteina. Oni će imati negativan naboj kada pH vrijednost otopine ima pH vrijednost višu od njihovog vlastitog pH. Stoga se pH razina proteina naziva izoelektrična točka proteina. Izoelektrično fokusiranje događa se kada se okolinom proteina manipulira pomoću električnog polja.
Kada se električno polje primijeni na okolinu proteina, to će utjecati na ponašanje čestica u proteinu. To znači da kada je protein podvrgnut okolišu koji je na istoj pH razini kao i on sam, čestice u proteinu se neće pomicati. Međutim, kada je protein podvrgnut okruženju koje ima niži pH od njega samog, čestice će se kretati prema katodi. Ako okolina proteina ima viši pH od vlastitog, čestice će se kretati prema anodi. Izoelektrično fokusiranje zahtijeva manipuliranje okolinom proteina tako da se njegove čestice kreću u željenom smjeru.