Konfokalni mikroskop je posebna vrsta fluorescentnog mikroskopa koji se koristi za dobivanje visokokvalitetnih 2D i 3D slika. Kod osnovnog (širokog) fluorescentnog mikroskopa, svjetlost određene valne duljine, obasjava se na uzorak, a uzorak apsorbira dio te svjetlosti, a ostatak reflektira na dužoj valnoj duljini. Svjetlost duže valne duljine prolazi kroz dikroično zrcalo, što omogućuje prolazak svjetlosti veće valne duljine, ali ne i izvornu (kraću) svjetlost valne duljine. Osoba koja promatra uzorak vidi samo svjetlost koja je prošla kroz dikroično zrcalo. Osnovni fluorescentni mikroskopi hvataju i svjetlo u fokusu i izvan fokusa, što dobro funkcionira za velike uzorke gdje nije potrebna vrlo visoka razlučivost. Ne radi tako dobro za gledanje finih detalja. Za snimanje fluorescentnih slika visoke rezolucije potreban je konfokalni mikroskop.
Konfokalni mikroskop koristi rupicu za odbijanje svjetlosti izvan fokusa. Umjesto da svjetlost prolazi samo kroz dikroično zrcalo, svjetlost prolazi i kroz dikroičko zrcalo i kroz rupicu, što znači da osoba koja promatra uzorak vidi samo jednu točku uzorka. Kako bi vidjeli cijeli uzorak, pomična zrcala skeniraju svjetlost preko pravokutne ravnine uzorka, a računalo prikuplja emitirano svjetlo dok se uzorak skenira. Kompletno skeniranje rezultirat će optičkim presjekom uzorka. Ova vrsta mikroskopije naziva se konfokalna laserska skenirajuća mikroskopija, dijelom zato što se laser koristi kao izvor svjetlosti.
Za izradu 3D slike radi se nekoliko skeniranja, stvarajući nekoliko “kriški” uzorka, a računalo kombinira svaku krišku kako bi stvorilo trodimenzionalnu sliku. Mikroskop se može programirati da mijenja razmak između kriški, ovisno o tome koliko oštru 3D sliku korisnik želi dobiti. Mikroskop također može mijenjati brzinu kojom skenira sliku, pri čemu sporo skeniranje daje višu razlučivost od brzog.
Konfokalni mikroskop je postao vrlo često korišteni dio opreme u mnogim laboratorijima znanosti o životu. Oni su skupi i donekle veliki, a često imaju prostorije namijenjene njihovoj uporabi, jer prostorija mora biti tamna kako bi se dobila dobra fluorescentna slika. Iako se konfokalni mikroskopi najčešće koriste za pregled stanica i struktura unutar stanica, mogu se koristiti za dobivanje slike bilo kojeg trodimenzionalnog fluorescentnog uzorka, a ponekad se koriste i za pregled poluvodičkih materijala.