Što je RNA amplifikacija?

Pomnožavanje RNA je proces koji uzima nekoliko kopija dijela ribonukleinske kiseline (RNA) i stvara tisuće kopija identičnog sastava. Komadići RNA su makromolekule, sastavljene od nizova nukleotida, pa je amplifikacija proces u nekoliko koraka koji uključuje reprodukciju točne sekvence nukleotida iz dijela RNA. Pojačavanje RNA korisno je u istraživanjima koja uključuju viruse, čiji se genetski materijal može pohraniti kao memorijska RNA (mRNA) umjesto DNK; proučavanje ekspresije gena u organizmima; i stvaranje proteina iz transkripcijske RNA (tRNA). Za pojačanje RNA stvara se i umnožava komplementarni slijed, a zatim se koristi kao predložak za stvaranje kopija RNA. Posrednik DNA potreban je za RNA amplifikaciju jer se RNA općenito javlja samo u jednolančanom, nesparenom obliku, tako da se DNK predložak mora stvoriti da bi enzim RNA transkriptaze funkcionirao; RNA se ne može prepisati iz same sebe.

RNA slijed od interesa mora se najprije izolirati iz kontaminantnog materijala prije nego što može započeti RNA amplifikacija. Nakon što je to učinjeno, enzim reverzna transkriptaza se dodaje u RNA šablon. Reverzna transkriptaza se koristi za stvaranje sekvence stanične DNA (cDNA) parova baza komplementarnih izvornoj mRNA. Ovaj prvi lanac cDNA se zatim može koristiti za stvaranje drugih lanaca cDNA koji se može koristiti u lančanoj reakciji polimeraze, procesu koji umnožava lance DNA kroz ponovljene cikluse replikacije DNA i naknadno odvajanje dva lanca. cDNA obično sadrži prajmere ili enzime na jednom kraju DNA sekvence, koji služe kao signali za vezanje nukleotida, a time i proizvodnju mRNA lanaca koji su identični izvornom slijedu.

Postoji nekoliko metoda za amplifikaciju RNA, ali metoda koja daje najveću količinu mRNA koja je vjerna izvornoj kopiji naziva se metoda prebacivanja predloška. Ova metoda koristi enzim reverzne transkriptaze iz virusa mišje leukemije Moloney, koji dodaje početni dio na kraj cDNA prvog lanca nakon stvaranja ovog lanca iz RNA šablona. Ova temeljna regija također je dodana drugom lancu cDNA, od koje se prave kopije amplificirane RNA. Drugi enzim, koji se naziva promotor, može se vezati na početnu regiju na drugom lancu cDNA, što drastično povećava količinu RNA kopija koje se proizvode iz ove cDNA lanca transkripcijom.