Bisulfitno sekvenciranje je metoda u kojoj se različite regije DNK analiziraju metilacijom. Metilacija je proces dodavanja specifične molekule, nazvane metilna skupina, nukleotidu, u ovom slučaju obično citozinu. Neaktivni nukleotidi često su metilirani, pa se ova metoda može koristiti u razne svrhe, od određivanja aktivnih regija genoma do identificiranja genom bogatih regija. U bisulfitnom sekvenciranju, metilirani citozini nisu pod utjecajem procesa sekvenciranja, dok se nemetilirani citozini pretvaraju u uracil, nukleotid koji se obično ne nalazi u genetskom materijalu, deoksiribonukleinskoj kiselini (DNK).
Ova metoda je vrlo osjetljiva na promjene u metilaciji, tako da male promjene u vezivanju mogu istraživačima dati specifične informacije o određenim nukleotidima. Natrijev bisulfit pretvara citozin u uracil, ali pretvorba se događa u okruženju u kojem metilirani citozin neće proći ovu promjenu. Kada je sekvenciranje bisulfita završeno, izvorna DNK je pretvorena u značajno drugačiju molekulu. Citozini će biti uvelike iscrpljeni ili potencijalno odsutni. Ako se citozin još uvijek nalazi u ovoj pretvorenoj molekuli, on predstavlja prirodno metilirani citozin u genomu koji se razmatra.
Kao i svi eksperimentalni protokoli, sekvenciranje bisulfita ima nedostatke. Najznačajniji nedostatak mu je što zahtijeva vrlo visoku koncentraciju soli da bi ispravno radio. Sol potiče žarenje jednolančane DNK u njezinu prirodniju dvostruku spiralu, a natrijev bisulfit ne može uvijek doći do citozina kada su oni dio dvolančane DNK. Ako je koncentracija soli previsoka, određeni broj citozina se možda neće pretvoriti u uracil, što rezultira lažnom identifikacijom metiliranih citozina unutar genoma. Denaturirajuća sredstva mogu biti potrebna kako bi se smanjio broj lažno pozitivnih identifikacija.
Velike količine genomskih podataka nisu potrebne za sekvenciranje bisulfita, tako da metoda ima korisnu primjenu u analizi kliničkih uzoraka. Izvorni izvor nukleinske kiseline nije bitan, ali izvor mora biti DNK. U teoriji, ribonukleinska kiselina (RNA) bi se mogla sekvencirati ovom metodom, budući da je većina RNA jednolančana i ne bi bila toliko osjetljiva na lažno pozitivne rezultate zbog blokiranih nukleotida. Međutim, kada se provede u praksi, sekvenciranje bisulfita nije korisno za RNA, jer RNA prirodno ima uracil u sebi. Bez neke vrste vanjske oznake ili dodatka protokolu, pretvoreni citozini ne bi se mogli razlikovati od prirodnog uracila.
Prilikom poduzimanja bilo koje vrste metodologije sekvenciranja, točnost i preciznost su bitne. Osjetljive metode poput bisulfitnog sekvenciranja nude pouzdano sredstvo za analizu sekvence, što zauzvrat omogućuje analizu gena i identifikaciju ciljeva za lijekove i terapije. Iako se ova metoda ne može koristiti na živim ljudima, još uvijek može biti od velike pomoći s najsitnijim uzorcima tkiva za rad.