Što je sekvenciranje sačmarica?

Sekvenciranje sačmaricama je metoda sekvenciranja DNK pri čemu se dugi dio DNK fizički razbija na male (otprilike 2,000 parova baza) fragmente koji se kloniraju, sekvenciraju i sastavljaju pomoću računalne analize. Razvio ga je i proslavio ga Craig Venter iz Celera Corporation. Venter je ovu tehniku ​​razvio 1996. dok je radio u Institutu za istraživanje genoma.

Venter je osnovao Celeru 1998. godine s misijom sekvenciranja ljudskog genoma u roku od tri godine. Ovaj cilj bio je u izravnoj konkurenciji s već aktivnim projektom Human Genome Project, konzorcijem sveučilišta koji zajedno rade na sekvenciranju ljudskog genoma koristeći stariju strategiju zvanu sekvenciranje temeljeno na karti ili BAC-to-BAC sekvenciranje. Ova metoda je prvo uključivala razbijanje genoma na 150,000 parova baza zvanih BAC-ovi, sastavljanje BAC-ova u redoslijedu, a zatim detaljno sekvenciranje svakog BAC-a.

Sekvenciranje cijelog genoma zaobilazi stvaranje i mapiranje BAC-ova i počinje odmah s sekvenciranjem DNK. Proces započinje stjecanjem uzorka DNK visoke molekularne težine iz organizma od interesa i fizičkim razbijanjem na male komadiće prolaskom kroz usku špricu ili ultrazvučnom obradom, što je način razbijanja uzorka pomoću zvučnih valova. Smicanje je slučajan proces, tako da će se slijedovi fragmenata preklapati. Smicanje ne stvara specifično 2,000 fragmenata parova baza potrebnih za sekvenciranje, nego se fragmenti željene veličine moraju pročistiti iz smjese.

Sljedeći korak je spajanje fragmenata DNK s DNK nosačem koji se naziva vektor. Ovaj proces je poznat kao kloniranje i stvara biblioteku sekvenciranja iz koje će se stvoriti slijed cijelog genoma. Određuje se slijed svakog klona u biblioteci, a računalna analiza se koristi za pronalaženje preklapajućih ili kontinuiranih sekvenci u svakom fragmentu. Sastavljanjem preklapanja stvara se “kontig”, koji je dugačak kontinuirani dio DNK sekvence.

Kloniranje puške obično će rezultirati nekim prazninama između kontiga jer neke sekvence slučajno nedostaju u knjižnici. Praznine se mogu popuniti stvaranjem nove biblioteke ili korištenjem poznatih sekvenci koje se protežu prema van od kontiga. Budući da sekvencioniranje sačmarica nasumično nasumično nasumično nasumično nasumično vrši sekvenciranje, mnogi fragmenti se sekvenciraju više puta, stvarajući veću sigurnost da je sekvenca točna nego da je svaki fragment sekvenciran samo jednom ili dvaput.

Ljudski genom je sekvencioniran i od strane projekta Human Genome koristeći sekvenciranje temeljeno na karti i Celera pomoću sekvenciranja sačmaricama. Sekvenciranje sačmaricama sada je poželjna metoda za druge vrste sekvenciranja genoma. Puni genomi mnogih organizama, kao što su biljka Arabidopsis thaliana, riža, krava, pas, piletina, čimpanza, štakor, miš, puhasta riba i mnogi mikroorganizmi su sekvencionirani na ovaj način.