Spektrofotometar je jedan od znanstvenih instrumenata koji se obično nalazi u mnogim istraživačkim i industrijskim laboratorijima. Spektrofotometri se koriste za istraživanja u laboratorijima fizike, molekularne biologije, kemije i biokemije. Obično se naziv odnosi na ultraljubičasto vidljivu (UV-Vis) spektroskopiju.
Energija svjetlosti ovisi o njezinoj valnoj duljini, koja se obično označava kao lambda. Iako se elektromagnetski spektar proteže na golem raspon valnih duljina, većina laboratorija može izmjeriti samo mali dio njih. UV-Vis spektroskopija mjeri između 200 i 400 nanometara (nm) za mjerenje UV svjetla i do približno 750 nm u vidljivom spektru.
Za UV-Vis spektroskopiju, uzorci se obično nalaze i mjere u malim spremnicima koji se nazivaju kivete. Oni mogu biti plastični ako se koriste u vidljivom spektru, ali moraju biti kvarc ili topljeni silicij ako se koriste za UV mjerenja. Postoje neki strojevi koji mogu koristiti staklene epruvete.
Vidljiva spektroskopija se često industrijski koristi za kolorimetriju. Koristeći ovu metodu, uzorci se mjere na više valnih duljina od 400-700 nm, a njihovi profili apsorpcije uspoređuju se sa standardom. Ovu tehniku često koriste proizvođači tekstila i tinte. Ostali komercijalni korisnici UV-Vis spektroskopije uključuju forenzičke laboratorije i pisače.
U biološkim i kemijskim istraživanjima otopine se često kvantificiraju mjerenjem njihova stupnja apsorpcije svjetlosti na određenoj valnoj duljini. Za izračunavanje koncentracije spoja koristi se vrijednost koja se naziva koeficijent ekstinkcije. Na primjer, laboratoriji molekularne biologije koriste spektrofotometre za mjerenje koncentracija DNA ili RNA uzoraka. Ponekad imaju napredni stroj nazvan NanoDrop™ spektrofotometar koji koristi djelić količine uzorka u usporedbi s onom koju koriste tradicionalni spektrofotometri.
Da bi kvantifikacija bila valjana, uzorak mora biti u skladu s Beer-Lambertovim zakonom. To zahtijeva da apsorpcija bude izravno proporcionalna duljini puta kivete i apsorpciji spoja. Dostupne su tablice koeficijenata ekstinkcije za mnoge, ali ne sve, spojeve.
Mnoge kemijske i enzimske reakcije mijenjaju boju tijekom vremena, a spektrofotometri su vrlo korisni za mjerenje tih promjena. Na primjer, enzimi polifenol oksidaze koji uzrokuju smeđe voće oksidiraju otopine fenolnih spojeva, mijenjajući bistre otopine u one koje su vidljivo obojene. Takve se reakcije mogu ispitati mjerenjem povećanja apsorbancije kako se boja mijenja. U idealnom slučaju, stopa promjene će biti linearna, a stope se mogu izračunati iz ovih podataka. Napredniji spektrofotometar imat će temperaturno kontrolirani držač kivete za provođenje reakcija na preciznoj temperaturi idealnoj za enzim.
Mikrobiološki i molekularni biološki laboratoriji često koriste spektrofotometar za mjerenje rasta kultura bakterija. Eksperimenti kloniranja DNK često se izvode na bakterijama, a istraživači moraju izmjeriti stadij rasta kulture kako bi znali kada provesti određene postupke. Oni mjere apsorbanciju, koja je poznata kao optička gustoća (OD), na spektrofotometru. Iz OD se može zaključiti da li se bakterije aktivno dijele ili počinju umirati.
Spektrofotometri koriste izvor svjetlosti za osvjetljavanje niza valnih duljina kroz monokromator. Ovaj uređaj zatim odašilje uski pojas svjetlosti, a spektrofotometar uspoređuje intenzitet svjetlosti koja prolazi kroz uzorak s onim koja prolazi kroz referentni spoj. Na primjer, ako je spoj otopljen u etanolu, referenca bi bila etanol. Rezultat se prikazuje kao stupanj apsorpcije razlike između njih. To ukazuje na apsorpciju spoja uzorka.
Razlog za ovu apsorpciju je taj što i ultraljubičasto i vidljivo svjetlo imaju dovoljno energije da potaknu kemikalije na višu razinu energije. Ova ekscitacija rezultira višom valnom duljinom, što je vidljivo kada se apsorbancija prikaže u odnosu na valnu duljinu. Različite molekule ili anorganski spojevi apsorbiraju energiju na različitim valnim duljinama. One s maksimalnom apsorpcijom u vidljivom rasponu ljudsko oko vidi obojene.
Otopine spojeva mogu biti bistre, ali apsorbiraju u UV području. Takvi spojevi obično imaju dvostruke veze ili aromatične prstenove. Ponekad postoji jedan ili više vrhova koji se mogu detektirati kada je stupanj apsorpcije prikazan u odnosu na valnu duljinu. Ako je tako, to može pomoći u identifikaciji nekih spojeva uspoređivanjem oblika grafikona s onim poznatih referentnih dijagrama.
Postoje dvije vrste UV-Vis spektrofotometarskih strojeva, jednosnopni i dvosmjerni. Oni se razlikuju po načinu mjerenja intenziteta svjetlosti između referentnog i ispitnog uzorka. Strojevi s dvostrukom zrakom istovremeno mjere referentni i ispitni spoj, dok strojevi s jednom snopom mjere prije i nakon dodavanja ispitnog spoja.