Western blot protokol je točan standard prema kojem se provodi imunoblot test. Western blot se koristi za otkrivanje proteina u uzorku tkiva. Proces odvaja prirodne proteine određivanjem duljine polipeptida pomoću gel elektroforeze. Sami proteini se zatim prenose na nitroceluloznu membranu i ispituju antitijelima.
Prvi dio western blot protokola počinje prikupljanjem tkiva. Ti se uzorci skupljaju ili iz živog tkiva ili iz stanične kulture. Tkivo se razgrađuje i uvode se različiti inhibitori poput proteaze ili fosfataze kako bi spriječili enzime da izvedu probavu. Ovaj dio protokola obično se obrađuje na niskim temperaturama kako bi se očuvala tkiva.
Proces gel elektroforeze sljedeći je korak u western blot protokolu. U ovom dijelu, proteini se identificiraju različitim čimbenicima kao što su molekularna težina ili električni naboj. Ovaj se proces najčešće završava korištenjem poliakrilamidnih gelova s puferom od natrijevog dodecil sulfata. U osnovi, proteini postaju negativno nabijeni i kreću se prema pozitivno nabijenoj elektrodi unutar gela.
Prijenos proteina je sljedeći dio ukupnog western blot procesa. Na vrh gela se postavlja membrana, a zatim filter papir. Kako se primjenjuje električna struja, proteini se uvlače u membranu. To se naziva stvarnim “blotirajućim” dijelom analize. Membrane su vrlo krhke i lako podložne oštećenjima.
Ispravan tijek western blot protokola zahtijeva korak poznat kao obvezivanje. Kako bi se spriječila kontaminacija samih proteina antitijelima koja se moraju dodati, potrebno je provesti svojevrsnu zaštitu. Najčešći tip blokiranja koristi nemasno suho mlijeko i deterdžent. To se veže na otvorena mjesta na membrani i omogućuje jasnije rezultate kada se doda antitijelo.
Detekcija je sljedeći korak prema ispravnom protokolu. Proteini se uvode u antitijela koja su povezana sa specifičnim enzimom koji će istraživačima dati željene informacije. Antitijelo se inkubira s membranom 30 minuta ili više. Nakon toga, membrana se ispere i uvede se sekundarno antitijelo koje se veže na prvo. Često se luminiscentno sredstvo koristi za pomoć znanstvenicima u procesu identifikacije.
Materijal se ponovno ispere kako bi se uklonili nevezani predmeti. Analiza veličine obojenih traka otkriva informacije o istaknutosti i opsegu specifičnog proteina. To se obično dovršava nekoliko puta kako bi se osigurala pravilna analiza. Opcije za detekciju uključuju rendgenske zrake, bojenje i kemikalije.